Aplicaciones de la Tecnología de Células Mamíferas

Las células mamíferas transgénicas son utilizadas para producir proteínas complejas que requieren un procesamiento celular que los microorganismos no pueden realizar. Las capacidades de procesamiento de estas células las convierte en unas muy versátiles y utilizadas en la industria biotecnológica. Una de las aplicaciones de esta tecnología es la producción de anticuerpos monoclonales (AcM). Un anticuerpo monoclonal es producido in vitro y puede reconocer solo un antígeno. Estos anticuerpos son producidos mediante la formación de hibridomas. Los hibridomas son líneas celulares que se reproducen continuamente y son conseguidos mediante la fusión de un linfocito que produce anticuerpos y un mieloma (célula cancerosa capaz de replicarse indefinidamente). Primero se presenta el antígeno a un organismo prueba, este proceso se conoce como inmunización y se hace para lograr la producción del anticuerpo. El antígeno puede suplirse por inyecciones intravenosas. Un aspecto importante a considerar es la selección de mieloma, por ejemplo para aplicaciones humanas se recomienda usar los que no secretan anticuerpos endógenos. Para realizar la fusión se utilizan electrofusión o glicol de etileno. Luego de que se haya dado la fusión las células son cultivadas en un medio de selección por unas dos semanas para eliminar así las células que no son hibridomas.
La especificad de los anticuerpos monoclonales los convierte en una herramienta como medida de diagnostico. Estos pueden localizar sustancias que ocurre en pequeñas cantidades como por ejemplo: contaminantes ambientales, detectar microorganismos dañinos en los alimentos, diagnosticar enfermedades infecciosas en humanos, plantas y animales mas rápido y acertadamente y pueden distinguir entre células cancerosas y células normales. Otra aplicación de los anticuerpos monoclonales es que pueden proveer compuestos terapéuticos específico. Un anticuerpo monoclonal unido a una toxina puede dar quimioterapia a una célula cancerosa sin afectar la célula normal.
Los siguientes son ejemplos de anticuerpos monoclonales utilizados para diferentes propósitos:
Para condiciones relacionadas al sistema inmunológico:
• Infliximab (Remicade)- para enfermedades inflamatorias como artritis reumatoide.
• Omalizumab (Xolair)- se enlaza a IgE y es utilizado para tratar el asma causada por alergias.
Eliminar células cancerosas:
• Ritumixab (Rituxan)- se enlaza a la molécula CD20 que se encuentra en la mayoría de las células B y usado para tratar los linfomas B.
• Cetuximab (Erbitux)- bloquea HER1 que es “epidermal growth factor” y fue aprobado para tratar el cáncer colorectal.

Hasta abril del 2005 existían 18 anticuerpos monoclonales aprobados para uso terapéuticos en los Estados Unidos. Otros productos además de los mencionados son producidos por diferentes compañías por ejemplo: Bayer AG produce Kogenate (Factor VIII para hemofilia A, células BHK, Afligen produce Benefix ( factor recombinante XI para hemofilia B), Genentech utiliza CHO para hacer Activasa ( para ataques del corazón).

Figura 1. Muestra los pasos básicos en la formación de un hibridoma. (www.cancerresearch.org/ immunology/techniques.html, editada por grupo células mamíferas).

Kohler G. (1985). Derivation and diversification of monoclonal antibodies. EMBO Journal. 4, 1358-365.

Kompala D. (2000) Cell Fusion- Hybridomas. Encyclopedia of Cell technology (pp. 381-382). Wiley-Interscience.

http://bio.org/speeches/pubs/er/application.asp

Las células de animales están siendo utilizadas además para la producción de proteínas complejas y vacunas en la biotecnología. Un ejemplo de esto es la vacuna para la influenza. Desde el 1940 vacunas para el virus de influenza han sido preparadas en huevos embrionarios pero actualmente se han consideran y utilizan células mamíferas para la producción de estas vacunas. Según una presentación expuesta en febrero del 2004 (preparada por Vaccines and Related Biological Products Advisory Commite) algunas de las ventajas de cambiar a la utilización de células mamíferas (Perspectiva de FDA) son su capacidad de aguantar el aislamiento del virus de influencia A de las especies, el que se tiene menos presión selectiva que en los huevos para el aislamiento del virus de influenza con receptores alternativos específicos, disponibilidad en muchos centros del WHO (líneas MDCK) sin embargo también mencionan desventajas como la limitada experiencia que se tiene en le desarrollo y producción de vacunas de influenza con esta células y problemas que pueden enfrentarse debido a contaminación de las líneas celulares. Hoy día ya existen regulaciones que monitorean el uso de células mamíferas en este proceso.
Actualmente en El Instituto Max. Planck un grupo de investigadores (Bioprocess Engineering) comenzaron en enero del 2000 a estudiar la producción de una vacuna para la influenza (“Influenza Vaccine Production in Microcarrier Systems”). Una de sus metas además investigar los procesos de desarrollo y la optimización y el control de estos procesos para la producción eficiente de vacunas. Con un proceso para la producción del virus de influencia como ejemplo ellos se concentran en el siguiente proceso: a) Cultivo y “scale- up” de células de animales (Madin Darby Canine Kidney ephitelial cells, MDCK) usando “microcarrier systems”, b) replicación del virus, c) “dowstream process”.

Figura 2. Representación del proceso antes mencionado.
http://www.mpi-magdeburg.mpg.de/research/projects/1088/1104/1105
www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/04/slides/4020S2_2.ppt

Actualmente existen enzimas y hormonas que son utilizadas con fines terapéuticos. Estas moléculas pueden producirse a partir de células mamíferas también. Hormonas como “Follicle stimulating hormone” (FSH) utilizada para tratamientos de infertilidad son producidas a partir de células CHO. Epogen es otra hormona que estimula la producción de células rojas y es producida por Amgen a partir de células mamíferas. Entre las enzimas se encuentran Cerezyme que es una enzima terapéutica para tratar la enfermedad de Gaucher’s que es un desorden metabólico hereditario, Genzyme Therapeutics produce ésta utilizando células CHO.
Esta información nos permite entender que la tecnología de DNA recombinante en células mamíferas nos proveen modelos excelentes para el estudio de enfermedades genéticas y en el futuro nos ayudara a continuar descubriendo nuevas drogas y así poder evaluar otras formas de terapia como terapia genética y celular.

Scott, C. (2004). Animal Cell Culture: High-Maintenance, but Worth the Trouble. BioProcess International. Chapter two. 22-32.

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Láminas de las líneas celulares más utilizadas

CHO (Chinese Hamster Ovary)

Vero (African green monkey kidney epithelial cells)

BHK-21 (Syrian hamster kidney fibroblasts)

NSO (Mouse myeloma Lymphoblast cells Like)

Referencias:
http://probes.invitrogen.com/lit/catalog/3/images/g000675.gif
http://dept.kent.edu/projects/cell/11-13-12.jpg
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/gallery/
cells/bhk/images/bhksmall.jpg
http://www.olympusfluoview.com/gallery/cells/vero/images/verolarge1.jpg

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Células Mamíferas: Descripción de la tecnología

En la actualidad se han desarrollados nuevos productos para el tratamiento de enfermedades humanas como anticuerpos y proteínas que requeiren ser producidas por células mamíferas dado a su complejidad, tamaño y las modificaciones posttransalacionales que requieren. Para lograr que la célula mamífera produzca la proteína o anticuerpo de interés es necesario aislar una célula del organismo y fusionarla con un tumor canceroso (generalmente del mismo tipo de célula) para hacer la célula inmortal. Esto se debe a que una célula cancerosa es una célula que empieza a dividirse descontrolada e infinitamente y no muere; de ahí el porque un tumor cancerigeno continua creciendo. Luego de eso el próximo paso es introducir el gen humano a la célula mamífera para que esta exprese la característica codificada en la secuencia del gen.

La introducción de genes en células mamíferas es un proceso muy difícil y poco eficiente. Usualmente se usan dos técnicas para introducir el gen al genoma de la célula mamífera: transfección e infección. . Transfección es el proceso de insertar un gen por medio de la utilización de cargadores físicos o mecánicos como lo seria el proceso de electroporación. Electroporación es el proceso por el cual la célula que se desea transformar es inducida por una corriente eléctrica a formar micro poros en su membrana por donde pasa el vector que carga la secuencia genética que queremos añadir al genoma de la célula mamífera. La otra forma es infección llevada a cabo por un virus. El virus es usado como cargador biológico donde el genoma viral lleva el gen humano que queremos insertar en la célula mamífera. Además del gen humano que se quiere insertar el vector que se introduce al genoma de la célula mamífera debe tener otro gen como marcador que nos ayude luego a identificar cuales células fueron transformadas efectivamente y cuales no. La mayoría de las veces un marcador puede ser un gen que le confiera a la célula resistencia a la presencia de algún compuesto tóxico o algún antibiótico.

Luego de esto se crea un medio donde la célula pueda crecer adherida a las paredes del reactor que contiene los nutrientes o en suspensión o sea flotando en un medio líquido. Una vez las células poseen las caracteristicas deseadas se crea un “Cell Bank” o una reserva de la célula donde se guardan las células para luego ser utilizadas. Los cell bank están regidos por las normas cGMP (current good manufacturing practices) y por las agencias reguladoras como la FDA para que la células que allí se guarden cumplan con los requisitos mínimos de seguridad establecidos para que no exista contaminación de la nueva célula y esta permanezca con las características adquiridas. Ya la células contiene la inserción del gen humano de interés por lo que ahora se colocan en un un medio rico en proteínas, vitaminas y minerales para que se desarrollen y dividan a la vez que liberen al medio el producto de interés. Anteriormente las células mamíferas eran crecidas en medios que contenian sueros provenientes de animales lo que era una fuente de contaminación viral y bacteriana causando un problema a la hora de purificar el producto por su alto contenido de proteínas. En la actualidad los medios utilizados son libres de suero lo que minimiza la contaminación y permite una purificación más eficiente del producto de interés.

Referencias:
Introduction of genes into mammalian cells http://boatman.med.wayne.edu/~xray/Lect_3.pdf

Media development for mammalian cell culture http://or-live.mediwire.com/main/default.aspx?p=content&articleID=162438

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Introducción

Las células mamíferas son células derivadas de organismos multicelulares. Estas células son de gran importancia puesto que poseen ciertas estructuras que le permiten sintetizar proteínas complejas a diferencia de los microorganismos y hongos. Ciertas lineas de celuas mamíferas han sido modificadas genéticamente para ser capaces de producir proteínas complejas. Con esta modificación genética nos referimos a la técnica conocida como técnica de DNA recombinante. La técnica de DNA recombinante se refiere a la transferencia de un gen de un organismo a otro; o sea la combinación de DNA que proviene de diferente fuentes. Ciertas líneas de células mamiferas son capaces de recibir esa modificacion, sobrevivir y lograr luego producir la proteína de interés que antes era incapaz de generar. Es debido a esta característica que actualmente las células mamíferas estan siendo utilizadas en la industria farmacéutica y biotecnológica para la producción de anticuerpos y proteinas que los microorganismos son incapaces de sintetizar. Algunas de las líneas celulares comunmente usadas para la producción de estas moléculas son: CHO(Chinese Hamster Ovary Cells), VERO(African green monkey kidney ephitel cells), NSO( Mouse myeloma lymphoblastoid like cells).

El poder llevar esta tecnología a un nivel industrial ha permitido suplir la demanda de medicamentos para un sin numero de tratamientos contra distintas condiciones. A su vez como consecuencia de este auge en el uso de productos biotecnológicos muchos países han crecido económicamente y se han convertido en grandes pioneros de lo que conocemos hoy como la Biotecnología moderna.

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